我们的重点

1.病毒载体概述

腺病毒伴随病毒(adeno-associated virus, AAV)是微小病毒科(Parvoviridae)家族的成员之一。这一家族成员是一类微小、无被膜及具有二十面体结构的病毒。病毒颗粒的直径在20~26nm之间,含有大小在4.7~6kb之间的线状单链DNA基因组。从昆虫到人类都已分离到微小病毒。AAV病毒属于依赖性病毒类(Dependovirus),最初是在纯化的腺病毒液中发现的一种污染成分(Atchinson et al. 1965), 顾而得名。

从鸟类到许多哺乳动物包括人的体内都分离到各种血清型的AAV病毒。大多数成年人都感染过AAV病毒,但尚未发现该病毒是任何疾病的致病因素。在多数情况下,AAV在培养的正常细胞中不发生产毒性感染,只有在有辅助病毒包括腺病毒或疱疹病毒共同感染时才发生产毒性感染(Hoggan et al. 1966; Buller et al. 1981)。因此,AAV病毒长期以来被认为是一种缺陷性病毒。进一步的研究发现AAV病毒并非缺陷性病毒,而是在正常细胞中偏向于建立潜伏感染,仅在宿主细胞受到刺激时才被诱发进行感染性增殖。

病毒载体的产生建立在对病毒的生活周期和分子生物学认识的基础之上。研究病毒载体首先要对病毒的基因组结构和功能有充分的了解,最好能获得病毒基因组全序列信息。病毒基因组可分为编码区和非编码区。编码区基因产生病毒的结构蛋白和非结构蛋白;根据其对病毒感染性复制的影响,又可分为必需基因和非必需基因。非编码区中含有病毒进行复制和包装等功能所必需的顺式作用元件。

基因重组技术的发展使病毒载体的产生成为可能。最简单的做法是,将适当长度的外源DNA插入病毒基因组的非必需区,包装成重组病毒颗粒。比如,本实验室曾将4.5kb的lacZ基因表达盒(CMV-lacZ-polyA)插入HSV1病毒的UL44(糖蛋白C)基因的XbaI位点中,病毒基因组的其余部分不改变,构建成重组病毒HSV1-lacZ100(吴小兵等,1998)。由于UL44基因产物对于HSV病毒在培养细胞中产毒性感染是非必需的,因此,该重组病毒可以在细胞中增殖传代。用这种重组病毒感染细胞,能将lacZ基因带入细胞并高效表达。用同样的方法,将AAV-2病毒的rep和cap基因片段(4.3kb)插入HSV1病毒的UL2(编码尿嘧啶DNA糖基化酶)或UL44(编码糖蛋白C)基因中,构建成具有提供重组AAV载体复制和包装所需的全部辅助功能的辅助病毒rHSV-rc(伍志坚等,1999)。

然而,这样的重组病毒作为基因转移载体有许多缺点。首先,许多野生型病毒通过在细胞中产毒性复制而导致细胞裂解死亡;或带有病毒癌基因而使细胞发生转化。因此必须经过改造使其成为复制缺陷性病毒并且删除致癌基因后才能用于基因治疗。其次,插入外源DNA的长度受到很大限制,尤其对于基因组本身较小的病毒如腺病毒伴随病毒(AAV,4.7kb)、反转录病毒(8~10kb)、腺病毒(36kb),如果不去除病毒基因,可供外源DNA插入的容量就十分小。因此,必须删除更多的病毒基因以腾出位置插入较大的外源DNA。 为了增加病毒载体插入外源DNA的容量,除了可以删除病毒的非必需基因外,还可以进一步删去部分或全部必需基因,这些必需基因的功能由辅助病毒或包装细胞系反式提供。

2.AAV载体发展历程

AAV载体的发现

1965年,随着Bob Atchison、M. David Hoggan和Wallace Rowe在腺病毒培养物里发现 “病毒样”颗粒,一种新型的细小病毒便开始了它在生物治疗领域的旅行。Atchison暂且将其命名为腺相关病毒(adeno-associated virus, AAV),随后Rowe使用了该命名。早期实验研究显示,该病毒在人源细胞中如果没有腺病毒的存在,即使可以复制,它的复制能力也非常低。然而,有一点非常明确,那就是AAV的免疫原性区别于任何已知的腺病毒抗原,而且发现并确定了AAV的三种血清型,分别为AAV1、AAV2和AAV3。.

在随后的几年里,科学家又发现AAV的外壳包裹一个单链DNA(ssDNA)基因组,该基因组含有末端反向重复序列(ITRs),ITR序列折叠成发夹结构,是其DNA复制起始和包装重组AAV病毒颗粒所需的唯一已知顺式作用元件。1980年,AAV2血清型的ITRs完成测序。随后,NIH在腺病毒感染一组细胞的研究中发现了AAV的产生,从而发现了该病毒的潜伏感染状态,同时也引导发现了少量的AAV基因组在宿主细胞染色体的整合。AAV具有细胞裂解的(Ad存在)和潜伏的(缺少Ad)双重生活周期,奠定了其作为基因治疗载体的研究基础。

AAV载体的基础研究

在80年代初期进行的分子生物学试验使用的都是AAV2血清型,当时已经知道该病毒基因组被包裹在外壳蛋白里面,而且转录图谱显示了来自三个启动子(P5,P19,P40)的三个mRNA重叠家族。基因组被分成左边部分、右边部分和三个外壳蛋白基因(VP1,VP2,VP3)。当时还不清楚左边部分基因组编码的蛋白,但是已经预测到了左边基因的复制功能。当时的科学家们所了解的事实是AAV可以在一个细胞中产生超过100,000个病毒颗粒。AAV这种高产的特性以及其无致病性促进了科学家进一步探索其作为基因治疗的导入工具的可能性。不幸的是,AAV需要在溶细胞的病毒存在下才能复制,所以不容易通过细胞噬斑的形成来筛选分离变异株。因而需要通过分子克隆技术将AAV DNA克隆到质粒中。在1980年的ASM会议上Barrie Carter提出,像腺病毒和AAV这样的重组DNA病毒的研究可以安全地在BSL-2级实验室进行。AAV基因组克隆入质粒的实现以及野生型AAV感染性克隆的分离,成为该研究领域重要的里程碑。

1978年,Jude Samulski构建了一个含有AAV全基因组的质粒pSM620,该质粒在有辅助病毒感染细胞的时候,可以通过转染细胞来实现拯救野生型AAV病毒颗粒。随后,科学家又证实了AAV ITRs是病毒复制的必要元件,完成了AAV2全基因组测序。

大约就在这个时候,第一次转导哺乳动物细胞被证实,Hermonat和Muzyczka构建了一个包含新霉素抗性基因的质粒,并成功拯救出AAV2病毒,转导效率为0.4~10%。这是AAV载体发展过程中另一重要的里程碑。此时,科学家们提出在该领域的很多方面都应该有更深入的探索,包括AAV全基因组中的基因表达、提高AAV的拯救效率、研究大片段外源DNA的插入、宿主范围突变体以及在基因治疗领域的应用等。所有这些方面的研究都将在接下来的30年中开展进行。

紧接下来的便是关于AAV基础病毒学方面的研究,病毒包装、复制和整合所必需的序列得以确认,并在载体质粒AAV2 pSM620基础上改造获得了psub201。该质粒中,AAV2基因组编码序列位于两个XbaI酶切位点之间,XbaI酶切消化可以去除96%的病毒基因,方便地插入外源基因,最大可容纳外源片段约5kb。 在1990年代初,AAV载体具有的整合特性被认为是基因持续表达和基因治疗应用的关键,因此确定AAV载体是否具有致癌性变得非常重要。Robert Kotin证实了野生型AAV整合到人基因组19号染色体q臂的特定位置。随后,又证明了AAV Rep蛋白是整合所需要的蛋白。与此同时,研究者将AAV载体带入罕见病的治疗领域。